ახალი თაობის სექვენირების შესახებ

მასიური პარალელური სექვენირება (Massive parallel sequencing) წარმოადგენს დნმ-ის სექვენირების მაღალი წარმადობის მქონე ტექნოლოგიას, რომელსაც ასევე უწოდებენ შემდეგი თაობის სექვენირებას (Next Generation Sequencing – NGS) ან მეორე თაობის სექვენირებას. აღნიშნული ტექნოლოგიის ზოგიერთი მიმართულება წარმოიშვა 1994-98 წლებში და კომერციულად ხელმისაწვდიომი გახდა 2005 წლიდან. NGS - ტექნოლოგიები სექვენირებისთვის იყენებს მინიატურულ ჩიპებს, რომელთა საშუალებით შესაძლებელია 1 მლნ-დან 43 მლრდ-მდე მოკლე რიდების (50-400 აზოტოვანი ფუძისგან შემდგარი დნმ-ფრაგმენტები) სინთეზი ერთი რეაქციის ფარგლებში.

NGS-პლატფორმები განსხვავდება როგორც ინჟინრული კონფიგურაციით, ასევე სექვენირების პრინციპით და ტექნოლოგიით. მათ შორის საერთოა მასიური პარალელური სექვენირების ტექნიკური პარადიგმა, რომელიც მკვეთრად განსხვავდება საგნერის, ასევე ცნობილი როგორც კაპილარული, ან პირველი თაობის სექვენირების პრინციპისგან.

დნმ-ის სექვენირება კომერციული პლატფორმების საშუალებით ძირითადად ხორციელდება რამოდენიმე თანმიმდევრულ ეტაპად. პირველ ეტაპზე მზადდება ე.წ. დნმ-ბიბლიოთეკა კლონური ამპლიფიკაციის გზით, პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის მეთოდის გამოყენებით. მეორე ეტაპზე ხორციელდება დნმ-ის სექვენირება მისი სინთეზის მეშვეობით, რომლის დროსაც დნმ-ის სექვენსი განისაზღვრება დნმ-მატრიცის კომპლემენტარულად ნუკლეოტიდების ჩართვის პარალელურად. მესამე ეტაპზე ამპლიფიცირებული ინდივიდუალური დნმ მონაკვეთები ბიოინფორმატიკული პროგრამის საშუალებით “ლაგდება” (mapping) შესაბამისი ანოტრებული (reference) გენომის მაგალითზე და მიიღება საკვლევი ობიექტის გენომის სრული თანმიმდევრობა. ადამიანის გენომის მაგალითზე თუ განვიხილავთ, 3 მლრდ აზტოვანი ფუძიდან თითოეული სექვენირდება მრავალჯერ, რის შედეგადაც პარალელურად ამპლიფიცირებული თანმიმდევრობები მაქსიმალური სიზუსტით გამოირჩევა. სრული გენომის სექვენირების და de novo  სექვენირების გარდა, NGS შესაძლებელია გამოყენებულ იქნას გენომის კონკრეტული მონაკვეთების წასაკითხად, მაგალითად ადამიანის 22 000 მაკოდირებელი გენის (exome) ან გენთა მცირე რაოდენობს სექვენირებისთვის.

Ion Torrent - ის NGS-პლატფორმებზე გამოყენებული ტექნოლოგია

ნახევარგამტარული იონური სექვენირება წარმოადგენს NGS-ტექნოლოგიას, რომელიც ეყრდნობა დნმ-ის მოლეკულის პოლიმერიზაციისას გამონთავისუფლებული წყალბადის იონების დეტექციას. აღნიშნულ ტექნოლოგიას ასევე უწოდებენ “სინთეზით სექვენირებას” ("sequencing by synthesis“), რომლის დროსაც დნმ-ის მატრიცული ჯაჭვის კომპლემენტარულად ხდება ახალი ჯაჭვის სინთეზი. ჩიპზე არსებულ მიკრო-ფოსოში, რომელშიც დნმ-ის მატრიცული მონაკვეთებია მოთავსებული, ემატება ერთი ტიპის დეოქსირიბონუკლეოტიდტრიფოსფატები (dNTP). თუ ფოსოში მოხვედრილი ნუკლეოტიდების ტიპი (ადენინი, გუანინი, ციტოზინი ან თიმინი) კომპლემენტარულად დაუკავშირდება მატრიცაზე სინთეზირებად ჯაჭვს, არეში გამონთავისუფლდება წყალბადის იონი და აღირიცხება იონური სენსორით (ISFET - ion-sensitive field-effect transistor), მინიატურული pH-მეტრით. ამრიგად, არეში არსებული ნუკლეოტიდის ტიპის და გამონთავისუფლებული იონის დეტექციის გზით შესაძლებელია აღირიცხოს რომელი ნუკლეოტიდის ჩართვა მოხდა კონკრეტულ პოზიციაზე დნმ-ის სინთეზირებად ჯაჭვში. თუ დნმ-თანმიმდევრობა ჰომოპოლიმერია (ერთი ტიპის ნუკლეოტიდის თანმიმდევრობით განმეორება), რამოდენიმე ნუკლეოტიდის ჩართვა სინთეზირებად ჯაჭვში თანმიმდევრულად მოხდება და არის pH შეიცვლება გამონთავისუფლებული წყალბადის იონების რაოდენობის პროპორციულად, შესაბამისად მიიღება მაღალი ელექტრონული სიგნალი.

სექვენირების აღწერილი პრინციპი განსხვავდება სხვა NGS-ტექნოლოგიებისგან, ვინაიდან ამ შემთხვევაში არ გამოიყენება მოდიფიცირებული (ფლუორესცენტულად მონიშნული) ნუკლეოტიდები და არ არის საჭირო ოპტიკური აღრიცხვის სისტემა. ნახევარგამტარული იონური სექვენირებას ასევე უწოდებენ Ion Torrent - სექვენირებას ან pH-დამოკიდებულ სექვენირებას.

ტექნოლოგიის განვითარტების ისტორია

ნახევარგამტარული იონური სექვენირება შემუშავდა Ion Torrent Systems - ის მიერ და DNA Electronics - ლიცენზიის მინიჭების შემდომ კომერციულად ხელმისაწვდომი გახდა 2010 წლის თებერვალში. Ion Torrent - ის პლატფორმები ცნობილია როგორც სწრაფი, კომპაქტური და ეკონომიური სექვენრატორი.

NGS - ის გამოყენება კლინიკური გენეტიკის პრაქტიკაში

NGS - მეთოდი, სანგერის სექვენირებისგან განსხვავებით, გამოირჩევა მუტაციების ფართო სპექტრის დეტექციის შესაძლებლობით. გენომური ვარიაციები ადამიანის გენომში გამოიხატება აზოტოვანი ფუძეების მოკლე მონაკვეთების ცვლილებით, მათი ინსერციებით ან/და დელეციებით, დიდი ზომის ექსონების დელეციებით, მთლიანი გენის თანმიმდევრობის ცვლილებით ინვერსიის ან ტრანსლოკაციის შედეგად. ტრადიციული სანგერის სექვენირების შეზღუდვას წარმოადგენს გენეტიკური თანმიმდევრობების ჩანაცვლებების, მცირე ინსერციების და დელეციების დეტექციის შეზღუდული შესაძლებლობა. ამიტომ სანგერის სექვენირებასთან ერთად, ხშირად საჭიროა დამატებითი მეთოდების გამოყენება, როგორიცაა in situ ჰიბრიდიზაცია (FISH) ან შედარებითი გენომური ჰიბრიდიზაცია (CGH) მიკრო-ჩიპების გამოყენებით, რათა გამოვლინდეს ქრომოსომული მონაკვეთების ასლთა რაოდენობის ცვლილებები, მაგ. მიკროდელეციები. აღწერილ შემთხვევებში NGS-ის გამოყენება საშუალებას იძლევა ერთი მეთოდით, ერთ რეაქციაში გამოვლინდეს გენომური ვარიაციების სრული სპექტრი. NGS-ის ერთადერთი შეზღუდვა ამ შემთხვევაში არის გენომის ის მონაკვეთები, რომელთა სექვენირება გართულებულია გუანინი/ციტოზინის მაღალი შემცველობის ან განმეორებადი თანმიმდევრობების გამო, მაგალითად როგორიც გვხვდება მსხვრევადი X-ქრომოსომის სიდრომის ან ჰანტინგტონის დაავადების შემთხვევაში.

NGS - ის მეშვეობით შესაძლებელია გენომის de novo სექვენირება

კაპილარული სექვენირება დამოკიდებულია მანამდე არსებულ ცოდნაზე იმ გენის ან ლოკუსის შესახებ, რომლის სექვენირებაც უნდა განხორციელდეს. NGS ხორციელდება სრულიად არა-სელექტიური პრინციპით და შედეგად მიიღება სრული გენომის ან ექსომების (მაკოდირებელი თანმიმდევრობების) სექვენსი, რომელიც გვაძლევს ინფორმაციას უცნობი დაავადების გამომწვევი ახალი მუტაციების შესახებ. პედიატრიაში ხშირია სინდრომები, რომლებიც აქამდე არ არის დახასიათებული და მათი გენეტიკური საფუძველის გამოსაკვლევად საჭიროა სრული გენომის სექვენირება. მიღებული მოლეკულური ინფორმაცია დეტალური კლინიკური ფენოტიპის აღწერასთან ერთად,  წარმატებით გამოიყენება სამომავლოდ მსგავსი სინდრომების იდენტიფიცირებისა და დიაგნოსტირებისთვის.

NGS - მეთოდის მაღალი სენსიტიურობა მოზაიკური მუტაციების დეტექციისთვის

მოზაიკური მუტაციები წარმოიშობა კვერცხუჯრედის განაყოფიერების შემდგომ უჯრედების დაყოფის ეტაპზე და შესაბამისად, მათი სიხშირე ცვალებადია უჯრედებსა და ქსოვილებში. სანგერის სექვენირებით აღნიშნული ვარიანტების დეტექცია ხშირად არ არის შესაძლებელი. NGS მეთოდი ამ შემთხვევაში გაცილებით უფრო სენსიტიურია და საშუალებას იძლევა გამოვლინდეს ისეთი გენეტიკური ვარიაციები, რომლებიც უჯრედების მხოლოდ რამოდენიმე პროცენტში გვხვდება. გარდა ამისა, სექვენირების სენსიტიურობა შესაძლებელია გაიზარდოს, რაც ხშირად აუცილებელია ისეთი მაღალსენსიტიური გამოკველებისას, როგორიცაა ფეტალური დნმ-ის გამოკვლევა დედის სისხლში ან სიმსივნური უჯრედების დონის განსაზღვრა სისხლში მოცირკულირე დნმ-ის სექვენირებით.

მიკრობიოლოგია

NGS - ის როლი მიკრობიოლოგიაში გამოიხატება პათოგენთა გენომის დეტექციით ტრადიციული მიკრობიოლოგიური მეთოდოლოგიის ჩანაცვლებაში, რომლის დროსაც მიკროორგანიზმთა დახასიათება ხორციელდება მათი მორფოლოგიის, შეღებვის მახასიათებლების და მეტაბოლური კრიტერიუმების მიხედვით. პათოგენთა გენომის წაკითხვა გვაძლევს საშუალებას არა მარტო განვსაზღვროთ მათი ზუსტი გენოტიპი, ასევე დავადგინოთ მათი სენსიტიურობა პრეპარატების მიმართ და ურთიერთ-კავშირი სხვა პათოგენებთან, რაც საერთო ჯამში ინფექციის საწყისი წყაროსი დეტექციას ამარტივებს. აქვე უნდა აღინიშნოს მეტაგენომური კვლევები, რომელთა განხორციელება ახალი თაობის სექვენირების მეთოდის გარეშე პრაქტიკულად შეუძლებელია. აღნიშნული მეთოგოლოგია ტრადიციული მიკრობიოლოგიური მიდგომებისგან განსხვავებით, არ საჭიროებს მიკრობული კულტურების ზრდას და გამორიცხავს კლასიკურ მიკრობიოლოგიურ ექსპერიმენტებთან დაკავშირებულ ისეთ ნაკლოვანებებს, როგორიცაა კულტივირებისთვის საჭირო დრო, დანახარჯები და ხშირად წარუმატებელი შედეგი რთულად კულტივირებადი შტამების შემთხვევაში.

ონკოლოგია

სიმსივნური გენომიკის მთავარი მახასიათებელია სომატური მუტაციები, რომლებიც გენომის მასშტაბით გვხვდება. NGS - ის მეშვეობით სიმსივნეთა გენეტიკის შესწავლა შესაძლებელია სისტემურად, რაც არა მარტო სწორი დიაგნოზის დასმის, ასევე დაავადების კლასიფიცირების, მისი მიმდინარეობის პროგნოზირების და თერაპიული მიდგომის სწორად შერჩევის შესაძლებლობებს ქმნის. სიმსივნის ინდივიდუალურ შემთხვევებში სექვენირების შედეგად შეასაძლოა დაავადების პერსონალიზებული მენეჯმენტი განხორციელდეს.